ПРИЛОЖЕНИЕ № 1
к приказу Минздравмедпрома РФ от 16.08.1994 г. № 170
Методические указания по организации лечебно-диагностической помощи и диспансерного наблюдения за больными ВИЧ-инфекцией и СПИДом
1.2. Лабораторные критерии для постановки диагноза ВИЧ-инфекции
Основным методом лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции является обнаружение антител к вирусу с помощью иммуноферментного анализа.
Антитела к ВИЧ появляются у 90-95% зараженных в течение 3-х месяцев после заражения, у 5-9% — через 6 месяцев от момента заражения и у 0,5-1% — в более поздние сроки. Наиболее ранний срок обнаружения антител — 2 недели от момента заражения. В терминальной фазе СПИД количество антител может значительно снижаться, вплоть до полного их исчезновения.
Серологическая диагностика инфекции ВИЧ на первом этапе строится на выявлении суммарного спектра антител против антигенов ВИЧ с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. На втором этапе методом иммунного блоттинга (Western blot) проводится определение антител к отдельным белкам вируса.
1.2.1. Забор материалов, транспортировка и хранение сывороток крови
Забор крови производится из локтевой вены в чистую сухую пробирку в количестве 3-5 мл. У новорожденных можно брать пуповинную кровь. Полученный материал не рекомендуется хранить более 12 часов при комнатной температуре и более 1 суток в холодильнике при +4-8° С. Наступающий гемолиз может повлиять на результаты анализа. Лучше всего сразу после взятия крови отобрать из нее сыворотку. Сыворотка отделяется центрифугированием или обводкой крови по стенке пробирки пастеровской пипеткой, либо стеклянной палочкой. Отделенная сыворотка переносится в чистую (лучше стерильную) пробирку, флакон или пластиковый контейнер, и в таком виде она может хранится до 7 дней при температуре +4-8° С.
При работе следует соблюдать правила техники безопасности, приведенные в "Инструкции по противоэпидемическому режиму в лабораториях диагностики СПИД" № 42-28/38-90 от 5 июля 1990 года.
1.2.2. Оборудование, необходимое для проведения иммуноферментного анализа
Для проведения лабораторных исследований с помощью ферментных методов необходимо иметь следующее оборудование:
- спектрофотометр;
- отмыватель планшетов;
- термостат;
- автоматические пипетки;
- наконечники к автоматическим пипеткам;
- центрифуги;
- холодильники;
- тест-системы.
В настоящее время в России рекомендовано к применению достаточное количество тест-систем для выявления антител к ВИЧ. Все они основаны на общем принципе иммуноферментного анализа.
Нагрузка на бригаду иммуноферментного анализа должна составлять до 400 исследований в смену, при условии оснащения современным автоматическим оборудованием и до 180-200 исследований, оснащенных отечественным рутинным оборудованием.
1.2.3. Иммуноферментный анализ
Принцип иммуноферментного анализа основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью фермента (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.) по изменению окраски специфического субстрата. Основной компонент твердофазных иммуноферментных тест-систем — полистироловый планшет с лунками или полистироловые шарики, на поверхности которых сорбирован антиген: вирусный лизат, рекомбинантные белки или синтетические антигенные детерминанты. Из всех модификаций твердофазного иммуноферментного анализа для диагностики инфекции, вызываемой ВИЧ, наиболее широко применяются непрямой и конкурентный варианты.
1.2.3.1. Принципы постановки непрямого метода иммуноферментного анализа
Предварительно приготовленный согласно инструкции, прилагаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вносится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет предварительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняются контрольными сыворотками, содержащими и не содержащими антитела к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т.к. интерпретация результатов зависит от значений оптической плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубируется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору.
Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сорбированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном антитела удаляются при отмывке планшета.
Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченые ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происходит образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Несвязавшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наиболее широко применяемым индикаторным ферментом для иммуноферментного анализа является пероксидаза хрена. Субстратом для нее является перекись водорода. Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение окраски раствора происходит при окислении красителей (ортофенилендиамина или др.), который входит в состав субстратного раствора.
Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом, происходит окрашивание только тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген-антитело-конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом неспецифического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.
1.2.3.2. Принцип постановки конкурентного метода иммуноферментного анализа
При конкурентном методе иммуноферментного анализа в лунки планшета с нанесенным антигеном одновременно вносятся исследуемые сыворотки и конъюгат. Конъюгат в данном случае — это антитела против ВИЧ, меченые ферментом. При последующей инкубации антитела, содержащиеся в сыворотке, и конъюгат вступают в конкурентное взаимодействие с иммобилизированными на твердом носителе антигеном. Если сыворотка содержит антитела, они взаимодействуют с антигеном, блокируя образование комплекса антиген-конъюгат. При отсутствии антител в сыворотке происходит образование комплекса антиген-конъюгат. Оставшиеся несвязанные компоненты после инкубации отмываются и в систему добавляется соответствующий субстрат. При наличии антител в сыворотке цветная реакция не развивается.
Таблица 1
Возможные ошибки при проведении иммуноферментного анализа
| № п/п | Типы дефекта | Видимые проявления | Возможные причины дефекта |
|---|---|---|---|
| 1. | Высокий фон | Значение оптической плотности в лунках с отрицательным результатом превышает 0,2 ед. |
|
| 2а. | Слабый сигнал | Значение оптической плотности положительного контроля ниже минимального значения оптической плотности, указанного в инструкции, значение оптической плотности положительных сывороток не превышает 0,4 ед. |
|
| 2б. | Слабый сигнал положительного контроля | Значение оптической плотности положительного контроля не превышает 0,4 ед. |
|
| 3. | Отсутствие сигнала | В лунках с позитивным контролем не произошло окрашивание |
|
При постановке иммуноферментного анализа в случае получения положительного результата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыворотка направляется в референс-лабораторию.
1.2.3.3. Иммунный блоттинг
В настоящее время для подтверждения специфичности первичного положительного результата чаще всего используется метод иммунного блоттинга — Western blot. Принцип метода заключается в выявлении антител к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса, данные об этих антигенах приводятся в таблице.
Таблица 2
| Группа белков | ВИЧ-1 | ВИЧ-2 |
|---|---|---|
| Белки оболочки вируса (env) | гп 160 кд, 120 кд, 41 кд | гп 140 кд, 105 кд, 36 кд |
| Белки сердцевины вируса (gag) | п 55 кд, 24 кд, 17 кд | п 56 кд, 26 кд, 18 кд |
| Ферменты вируса (pol) | п 66 кд, 51 кд, 31 кд | п 68 кд |
| Примечание: Молекулярный вес белков выражается в килодальтонах - кд, гп - гликопротеины, п - протеины. | ||
Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы производится следующим образом. На первом этапе производят разделение белков вируса иммунодефицита человека по молекулярному весу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низким молекулярным весом проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высоким молекулярным весом и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярному весу. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверхность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрана обрабатывается блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сывороток крови, затем отмывается, высушивается и разрезается на отдельные полоски, которые вкладываются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоке) с помощью непрямого анализа, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом; если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они связываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мембрану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген-антитело, конъюгат присоединяется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с субстратом происходит окрашивание тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген-антитело-конъюгат. Полученный результат сравнивается с результатами тестирования положительной и отрицательной контрольных сывороток.
Результаты, полученные в иммунном блоттинге интерпретируются как положительные, сомнительные и отрицательные.
Таблица 3
Рекомендуемые критерии оценки результатов иммунного блоттинга
| Название центров | Положительный результат | Сомнительный результат | Отрицательный результат |
|---|---|---|---|
| 1. ВОЗ | Сочетание полос к гп 41 и гп 120, или гп 41 и гп 160, или гп 120 и гп 160 | Полосы к другим антигенам ВИЧ | Отсутствие полос к какому-либо из антигенов ВИЧ |
| 2. Российский центр по профилактике и борьбе со СПИД | Полосы хотя бы к одному из белков гп 41, гп 120, гп 160 в сочетании с другими полосами или без них | Полосы к другим антигенам ВИЧ | Отсутствие полос к какому-либо из антигенов ВИЧ |
| Примечание: Рекомендации Российского центра учитывают опыт работы с сывороткам детей из внутрибольничных очагов, у которых часто определялись антитела только к одному из белков оболочки вируса. Своевременная постановка диагноза у таких детей позволила быстро начать противоэпидемические мероприятия и специфическую терапию. | |||
Вопросы стандартизации и интерпретации результатов иммунного блоттинга были рассмотрены на совещании экспертов ВОЗ в Женеве 22-23 апреля 1990 г.
Согласно этим рекомендациям при наличии реакции только из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (через 3 месяца). Наличие положительной реакции с п 24 может указывать на период сероконверсии. В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятой через 2 недели.
Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, либо указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лица с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 должны повторно исследоваться через 3 месяца (в течение 6 месяцев). Если через 6 месяцев вновь будут получены неопределенные результаты (отсутствие реакции с белками env ВИЧ-1 и ВИЧ-2), а также не будут выявлены факторы риска и клинические симптомы иммунодефицита, можно сделать вывод о неспецифической реакции. Наличие неспецифической реакции не дает основания для постановки диагноза ВИЧ-инфекции, но доноров, имеющих такой результат, от донорства необходимо отстранить.
Результаты серологических исследований используются эпидемиологами и практическими врачами для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, своевременного выявления источника инфекции, скорейшего проведения противоэпидемических мероприятий и оказания помощи зараженным лицам. На основании только лабораторного анализа диагноз не может быть выставлен. Для вынесения диагностического заключения необходимо учитывать данные эпидемиологического анамнеза, иммунологических тестов и результатов клинического обследования.
Приложения к приказу № 170 от 16.08.1994
• Текст приказа. Утверждаю и приказываю.
1. Методические указания по организации лечебно-диагностической помощи и диспансерного наблюдения за больными ВИЧ-инфекцией и СПИДом.
- Этиология, патогенез
- Лабораторная диагностика
- Классификация и диагноз
- Терапия ВИЧ-инфекции
- Диспансеризация
4. Положение о кабинете психосоциального консультирования и добровольного обследования на ВИЧ
